روشهای بیوشیمی مطالعة سلول

سیتوشیمی

     با كمك روشهای سیتوشیمی می‌توان ساختمانهای شیمیایی اجزاء سلول را در وضعیت طبیعی ( In Situ ) آن شناخت دو راه را برای این منظور وجود دارد :

1) استفاده از مواد شیمیایی كه در اثر تماس با مواد دیگر درون سلول واكنشی ظاهر سازند كه به كمك میكروسكوپ الكترونی قابل رؤیت است .

     برای مطالعة با میكروسكوپ نوری بایستی این مواد شیمیایی رنگی باشند و برای مشاهده در میكروسكوپ الكترونی باید این مواد مانع حركت الكترونها، یا باعث پراكندگی آنها گردند. (1)

2 ) امكان دوم استفاده از آنزیم‌هایی است كه بطور اختصاصی موادی را تجزیه نمایند این مواد بعداً در سلول قابل رؤیت نیستند تعیین اینكه محصول یك واكنش جزئی از ساختمان سلول است یا خیر زمانی ممكن است كه نتیجه واكنش سبب انباشتگی و تراكم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر این واكنش باید طوری اختصاصی باشد كه قضاوت قابل اعتمادی را ممكن سازد از طرف دیگر اجزاء سلولی به قدر كفایت طبیعی باقی بمانند تا مقایسه و قضاوت را ممكن سازند (مثلاً تراكم موادی در میتوكندری زمانی قابل اثبات است كه ساختمان میتوكندری به شكل طبیعی آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن می‌گردد :

     در نقاط مختلف سلول فسفاتاز یعنی آنزیمی كه هیدرولیز فسفات را تسریع می‌نماید وجود دارد اگر یك سلول ثابت شده با آلدئید را (آلدئید فعالیت آنزیمی را از بین نمی‌برد) با مخلوطی از فسفات محلول و نیترات سرب مجاور كنیم (قطره‌ای روی بافت قرار می‌گیرد) در نقاطی كه آنزیم موجود است فسفات هیدرولیز شده و تولید اسید فسفریك می‌نماید كه خود در اثر تركیب با نیترات سرب فسفات سرب به وجود می‌آورد .

     این تركیب غیر قابل حل در آب بوده و تولید رسوبی می‌نماید كه به شدت الكترونها را متفرق می‌كند به این ترتیب تمام نقاطی كه دارای فسفاتاز هستند در سلول مشخص می‌گردند .

     دیواره غالب سلولهای گیاهی دارای سلولز می‌باشد كه با املاح فلزات سنگین كنتر است ندارد اگر آنزیم سلولاز را روی سلول ثابت شده با آلدئید اثر دهیم سلولز به موادی كه ملكولهای ریز قابل حل در آب تبدیل می‌گردند این عمل منجر به از بین رفتن كنتر است تقاطعی كه قبلاً سلولز وجود داشت می‌گردد با این روش می‌توان پی به مقدار كمی سلولز در دیواره سلولزی و احتمالاً چگونگی سنتز آن پی برد . (2)

 اتورادیوگرافی ( AUTORADIOGRDHY ) :

     ایزوتوپهای رادیواكتیو ایزوتوپهایی هستند كه هسته آنها در اثر تشعشع پیوسته تحلیل می‌رود این گونه ایزوتوپها در سیتولوژی برای ردیابی مواد معینی در سلول به كار گرفته می‌شود با كمك منوساكاریدهای علامت‌گذاری شده با₁₄ Cمی‌توان بوسیله روشهای اتورادیوگرافی یا به طور مستقیم توسط اندازه‌گیری فعالیت تشعشعی اجزاء مختلف سلول سنتز پلی‌ساكاریدها را مشخص كرد روش اخیر با كمك دستگاه مخصوصی به نام سین‌سیلاسیون شمار (نور ساطع كردن و برق زدن = Scintilation ) انجام می‌گیرد .

     در روش مستقیم اتورادیوگرافی می‌توان از میكروسكوپ نوری یا الكترونی استفاده كرد در هر دو مورد بافت بعد از دریافت ماده رادیو اكتیو ( خوراندن ـ تزریق ) ثابت آغشته و برش داده می‌شود مقاطع بعداً با لایه‌ای حساس یا فیلم پوشانده می‌شوند تشعشعات ماده رادیو اكتیو مثل اشعه نور صفحه فیلم یا ماده حساس دیگر را متأثر و فیلم پس از ظهور در محل سیاه شده مورد مطالعه قرار می‌گیرند شرط موفقیت دراتورادیوگرافی انتخاب ماده حساس برای پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقیق برای تأثیر اشعه و بالاخره ظاهر كردن مناسب ماده حساس یا فیلم می‌باشد معذالك نمی‌توان از این روش در هر موردی از سیتولوژی استفاده نمود اتورادیوگرافی بیش از هر روش دیگر به دقت و تجربه نیازمند است . (2)

 جداسازی اجزاء سلول :

     برای انجام آزمایشات شیمی با اندازه‌گیری و مطالعه عمل اجزاء مختلفه یك سلول : لازم است كه این اجزاء از بقیه قسمتها جدا گردند برای این منظور سلولها هموژن می‌شوند بعد محتویات سلولها با كمك اولترا سانتریفوژ به صورت بخشهای مستقلی كه هر یك محتوی ساختمان خاصی از سلول هستند از هم جدا می‌گردند .

     عمل هموژن كردن در سلولهائی كه با دیواره سختی پوشیده نمی‌شوند از طریق شوك اسمزی با تأثیر امواج صوتی بالای Hkz 20 صورت می‌گیرد .

     سلولهای بادیواره سخت بایستی در هموژنیزاتور با چاقو یا گلوله‌های شیشه‌ای ذرات كوارتز و نظایر آن ساییده شوند در هر حال این عمل نباید موجب آسیب و در نتیجه كاهش فعالیت اجزاء سلولهای گردد عمل سانتریفوژ كردن در دو مرحله انجام می‌گیرد :

1 ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION

2 )‌جدا كردن به طریق هموژنی ( ISOPICNIC )

كروماتوگرافی ( CHROMATOGRAPHY ) :

     با كمك روشهای كروماتوگرافی ملكولهای مختلف بر اساس ویژگیهای متفاوت خود نظیر ملكول‌ها ( فیلترژله‌ای ) حلالیت در دو فاز ( كروماتوگرافی تقسیمی ) و بالاخره خصوصیات جذبی ( كروماتوگرافی جذبی ) از یكدیگر جدا می‌گردند . (3)